Le collezioni del museo sono suddivise in 59 sezioni, disposte su una superficie di 12.000 metri quadri. Le sale hanno un’altezza media di 10 metri e uno sviluppo parietale complessivo di oltre 3 chilometri.
Le prime 14 sale offrono una sintesi storica di Roma dalle origini al VI secolo d.C.; ad esse fa seguito una sezione dedicata al Cristianesimo.
Il complesso che ospita il museo fu progettato dagli architetti Aschieri, Bernardini, Pascoletti e Peressutti, vincitori di uno dei concorsi banditi per la costruzione degli edifici più rilevanti dell'Esposizione Universale di Roma nel 1942. Tra i progettisti ebbe un ruolo preminente Pietro Aschieri che, con la creazione di una struttura maestosa e un po' magniloquente, potè esprimere appieno le sue concezioni, ispirate a un classicismo di impronta scenografica.